非标定量磷酸化-康成生物丨数谱生物
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          非标定量磷酸化

          • 简介
          • 实验流程
          • 案例展示
          • 样品要求
          •        蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰(PTM),它动态可逆的调控细胞中几乎任意一个生物学过程。磷酸化信号通路的失调是癌症等诸多疾病的标志性事件,同时蛋白激酶也是许多药物的主要作用靶点,因此具有极大的研究价值[2]。伴随着基于质谱的蛋白质组学技术和磷酸化多肽富集方法以及高通量定量技术的不断发展,磷酸化蛋白组学已经成为目前最为成熟的PTM研究方向。TiO2对磷酸化多肽具有很高的特异性,广泛运用于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(pSTY)的磷酸化富集研究;酪氨酸磷酸化(pY)丰度往往较低,TiO2富集后也较难检测,通常需要采用特异性抗体进行富集,或与TiO2串联富集。结合磷酸化富集技术的高效性与质谱技术的高通量,深入研究在各种生理病理条件下磷酸化蛋白组动态变化过程变得实际可行且意义重大。


            图1.定量磷酸化蛋白组技术原理和磷酸化信号调控的多种生物学过程[3]。

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            参考文献

            1. Larance, M. & Lamond, A. I. Multidimensional proteomics for cell biology. Nature reviews. Molecular cell biology 16, 269-280, doi:10.1038/nrm3970 (2015). [PMID: 25857810].
            2. Macek, B., Mann, M. & Olsen, J. V. Global and site-specific quantitative phosphoproteomics: principles and applications. Annual review of pharmacology and toxicology 49, 199-221, doi:10.1146/annurev.pharmtox.011008.145606 (2009). [PMID: 18834307].
            3. Humphrey, S. J., James, D. E. & Mann, M. Protein Phosphorylation: A Major Switch Mechanism for Metabolic Regulation. Trends in endocrinology and metabolism: TEM 26, 676-687, doi:10.1016/j.tem.2015.09.013 (2015). [PMID: 26498855].





          • Label-free定量

          •        运用高通量label-free定量磷酸化蛋白组学技术分析极短时间(30s)和中等时间(10min)段内胰岛素刺激对蛋白磷酸化水平的影响,据此来研究早期胰岛素信号传递过程和动态调控关系[4]。
                   运用高通量磷酸化蛋白组学技术研究胰岛素在0-30s以及0-10min时间段内蛋白磷酸化水平变化趋势(a)。对时间分辨的磷酸化蛋白组数据进行聚类分析,能够发现胰岛素信号通路中的功能相关节点,粗体显示节点中的新成员(b)。


                   根据蛋白磷酸化水平变化模式,发现新的生物学现象:(a)两个相距很近的磷酸化位点具有截然不同的磷酸化模式,意味着不同的调控模式。(b)研究信号通路间的cross-talk。由Frs2介导的INSR通路与FGFR通路间的cross-talk。


          • 样品类型 样品要求
            蛋白质提取物 浓度 >1μg/μl,蛋白质总量 >4mg
            细胞样品 细胞量 >2×107
            组织样品 动物、微生物组织湿重 >100mg

            注:酪氨酸磷酸化需要更多的蛋白样品,详情请咨询Aksomics技术人员。

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